Материал для ПЦР-исследований.
Правила взятия, обработки и хранения биопроб.
Для получения адекватных результатов ПЦР-анализа большое значение имеет качество взятия образца для исследования, его хранение, транспортировка и предварительная обработка.
ПЦР-анализ относится к прямым методам лабораторного исследования — образец анализируется на наличие ДНК возбудителя. Поэтому для ПЦР-анализа пригоден любой клинический материал, потенциально содержащий возбудителей инфекций. Выбор клинического материала для анализа должен определяться наиболее вероятным местом локализации возбудителя. Адекватный материал для выявления возбудителя приведен в описаниях комплектов для амплификации соответствующих микроорганизмов.
Общие рекомендации по взятию биопроб для ПЦР-анализа:
1. Взятие материала производится из предполагаемого места обитания микроорганизма. Различные микроорганизмы имеют свои особенности локализации, пути распространения и выделения. Это следует учитывать при выборе наиболее адекватного места взятия биопробы.
2. Взятие биологического материала, по-возможности, должно проводиться в период обострения инфекции. За 10 дней до взятия материала на исследование необходимо прекратить прием химиопрепаратов и лечебные процедуры. Материал для исследования у женщин следует брать перед менструацией или через 1-2 дня после ее окончания. Женщины накануне обследования не должны проводить туалет наружных половых органов и спринцевание. Взятие биоматериала для контроля эффективности лечения должно проводиться не ранее чем через 4 недели после окончания терапии.
3. Количество материала, забираемого для исследования не должно быть избыточным, т.к. вместе с возбудителем в пробу попадают вещества, которые могут вызывать ингибирование ПЦР или могут способствовать деградации ДНК при хранении и транспортировке. При взятии мазков и соскобов достаточное количество материала — размером “со спичечную головку”. Наиболее адекватным инструментом для взятия соскобов и мазков для ПЦР-анализа является специальный урогентиальный зонд (щеточка), который собирает необходимое количество эпителия, не травмируя слизистую, почти не впитывает образец и хорошо отдает собранный материал в жидкую транспортную среду.
4. Для взятия биопроб необходимо пользоваться только одноразовым инструментом и одноразовыми пластиковыми контейнерами (или пробирками с транспортной средой) с плотно закрывающейся или завинчивающейся крышкой.
Взятие материала для ПЦР-исследований:
| БИОПРОБЫ ИЗ УРОГЕНИТАЛЬНОГО ТРАКТА | БИОПРОБЫ ИЗ УРОГЕНИТАЛЬНОГО ТРАКТА |
| ЖЕНЩИНЫ | |
| Соскоб эпителиальных клеток из цервикального канала | - перед взятием материала необходимо удалить ватным тампоном слизь и затем обработать шейку матки стерильным физиологическим раствором; - зонд ввести в цервикальный канал на глубину 0,5-1,5 см, собрать материал осторожными вращательными движениями; - при наличии эрозий цервикального канала обработать их стерильным физиологическим раствором, и брать материал на границе здоровой и измененной ткани; - при извлечении зонда полностью исключить его касание со стенками влагалища. |
| - зонд ввести в цервикальный канал на глубину 0,5-1,5 см, собрать материал осторожными вращательными движениями; | |
| - при наличии эрозий цервикального канала обработать их стерильным физиологическим раствором, и брать материал на границе здоровой и измененной ткани; | |
| - при извлечении зонда полностью исключить его касание со стенками влагалища. | |
| Соскоб эпителиальных клеток из уретры | - непосредственно перед взятием материала наружное отверстие уретры обработать тампоном, смоченным стерильным физиологическим раствором; - провести массаж уретры о лобковое сочленение; - ввести зонд на глубину 1,0-1,5 см, собрать материал осторожными вращательными движениями. |
| Мазок с заднего свода влагалища | - материал должен быть взят до проведения мануального исследования; - зеркало перед манипуляцией можно смочить горячей водой, применение антисептиков для обработки зеркала противопоказано; - в случае избытка слизи или обильных выделений удалить их стерильным ватным тампоном; - влагалищное отделяемое собрать проводя стерильным одноразовым зондом по поверхности |
| Погрузить зонд в пробирку с 200 мкл реагента “ДНК-ЭКСПРЕСС” (или в пробирку с 150 мкл физ.раствора), несколько раз вращать и, отжав остатки раствора о стенки, удалить из пробирки. Пробирку плотно закрыть и промаркировать. Оставлять наконечник зонда в пробирке с биопробой не рекомендуется. | Погрузить зонд в пробирку с 200 мкл реагента “ДНК-ЭКСПРЕСС” (или в пробирку с 150 мкл физ.раствора), несколько раз вращать и, отжав остатки раствора о стенки, удалить из пробирки. Пробирку плотно закрыть и промаркировать. Оставлять наконечник зонда в пробирке с биопробой не рекомендуется. |
| БИОПРОБЫ ИЗ УРОГЕНИТАЛЬНОГО ТРАКТА | |
| МУЖЧИНЫ | |
| Соскоб эпителиальных клеток из уретры | - перед взятием материала пациенту рекомендуется воздержаться от мочеиспускания в течение 1,5-2 часов; - непосредственно перед взятием материала наружное отверстие уретры обработать тампоном, смоченным стерильным физиологическим раствором; - при наличии гнойных выделений соскоб рекомендуется брать через 15-20 мин после мочеиспускания, при отсутствии выделений необходимо провести массаж уретры с помощью зонда для взятия материала; - ввести зонд на глубину 3-4 см, собрать материал осторожными вращательными движениями. - погрузить зонд в пробирку с 200 мкл реагента “ДНК-ЭКСПРЕСС” (или в пробирку с 150 мкл физ.раствора), несколько раз вращать и, отжав остатки раствора о стенки, удалить из пробирки. Пробирку плотно закрыть и промаркировать. - Оставлять наконечник зонда в пробирке с биопробой не рекомендуется. |
| Секрет предстательной железы | - перед взятием секрета простаты головку полового члена обработать стерильным ватным тампоном, смоченным физиологическим раствором; - после предварительного массажа простаты через прямую кишку из кавернозной части выдавливается простатический секрет; - около 0,5-1 мл секрета простаты собрать в одноразовую сухую стерильную пробирку; - обработка перед выделением ДНК: 20-30 (максимум 50) мкл жидкого образца внести пипеткой в пробирку с 200 мкл реагента “ ДНК-ЭКСПРЕСС” (или в пробирку с 150 мкл физ.раствора). Учитывая необходимость аккуратного дозирования образца данную манипуляцию лучше проводить в лаборатории непосредственно перед выделением ДНК. |
| Сперма | - сперму собрать в одноразовую сухую стерильную пробирку; обработка перед выделением ДНК: 20-30 (максимум 50) мкл жидкого образца внести пипеткой в пробирку с 200 мкл реагента “ ДНК-ЭКСПРЕСС” (или в пробирку с 150 мкл физ.раствора). Учитывая необходимость аккуратного дозирования образца данную манипуляцию лучше проводить в лаборатории непосредственно перед выделением ДНК. |
| ВЕНОЗНАЯ КРОВЬ и ЕЕ КОМПОНЕНТЫ (взятие крови производят натощак из локтевой вены одноразовой иглой) | ВЕНОЗНАЯ КРОВЬ и ЕЕ КОМПОНЕНТЫ (взятие крови производят натощак из локтевой вены одноразовой иглой) |
| Плазма | - кровь собрать в одноразовую пластиковую пробирку с раствором антикоагулянта (0,05М раствор ЭДТА или 4% раствор цитрата натрия в соотношении 500 мкл крови на 50 мкл антикоагулянта). Гепарин использовать не рекомендуется. Можно использовать специальные вакуумные системы типа “Vacuette” с раствором ЭДТА; - пробирку закрыть и аккуратно встряхнуть для перемешивания крови с антикоагулянтом; - центрифугировать пробирки в течение 20 мин при 3000 об/мин при комнатной температуре; - полученную плазму (верхняя фаза) отобрать индивидуальным наконечником с фильтром (аэрозольным барьером) в количестве не менее 1 мл в сухую стерильную пластиковую пробирку типа Эппендорф объемом 1,5 мл. |
| Сыворотка | - кровь собрать в сухую одноразовую пластиковую пробирку; - дать отстояться крови при комнатной температуре в течение 30 мин до полного образования сгустка; - центрифугировать пробирки в течение 10 мин при 3000 об/мин при комнатной температуре; - полученную сыворотку (верхняя фаза) отобрать индивидуальным наконечником с фильтром (аэрозольным барьером) в количестве не менее 1 мл в сухую стерильную пластиковую пробирку типа Эппендорф объемом 1,5 мл. |
| Лейкоцитарная масса | - 500 мкл крови собрать в одноразовую пластиковую пробирку с 50 мкл раствора антикоагулянта (0,05М раствор ЭДТА или 4% раствор цитрата натрия). Гепарин использовать не рекомендуется. - пробирку закрыть и аккуратно встряхнуть для перемешивания крови с антикоагулянтом; - центрифугировать пробирки в течение 5 мин при 3000 об/мин при комнатной температуре;плазму (верхняя фаза) отбрасывают с использованием индивидуального наконечника; - полученная клеточная масса крови (нижняя фаза) пригодна для выделения ДНК с использованием фенол-хлороформной экстракции (”Набор для выделения ДНК/РНК из сыворотки или плазмы крови”); - для получения лейкоцитарной массы ее необходимо отмыть от эритроцитов; - Методика отмывки: К 300 мкл осадка клеточной массы крови добавить 1 мл буфера (10мМ трис-HCl, 5мМ MgCl2,10мМ NaCl) и оставить на 20 мин при комнатной температуре до полного гемолиза эритроцитов. Отцентрифугировать 5 мин при 3000 об/мин. Процедуру повторить 2 раза. Полученная отмытая лейкоцитарная масса пригодна для выделения ДНК с помощью комплектов для выделения ”ДНК-ЭКСПРЕСС” и “Набора для выделения ДНК из биологических образцов”. |
| ПРОЧИЕ ОБРАЗЦЫ | |
| Осадок мочи | - собрать первую порцию утренней мочи в количестве 20 мл в сухой стерильный флакон с плотно завинчивающейся крышкой; - моча для исследования должна быть свежей (не охлаждать и не замораживать!); - получение осадка мочи: - весь объем мочи тщательно взболтать и 10-15 мл отобрать в стерильную центрифужную пробирку. Центрифугировать 15-20 мин при 1,5-3000 об/мин, надосадочную жидкость осторожно удалить, стараясь не захватить на дне 0,5-1 мл суспензии; - 0,5-1 мл суспензии осадка перенести в одноразовую пробирку типа Эппендорф (1,5мл); - пробирку плотно закрыть и центрифугировать при 8 - 12000 об/мин при комнатной температуре в течение 15 сек; - тщательно удалить пипеткой надосадочную жидкость; - при необходимости (подозрение на охлаждение исходной мочи) можно однократно промыть осадок: добавить к осадку 200 -300 мкл физ.раствора, ресуспендировать на вортексе, отцентрифугировать и удалить надосадочную жидкость; - к осадку в пробирке добавить весь реагент (200 мкл) из одной пробирки из комплекта “ДНК-ЭКСПРЕСС” , тщательно перемешать пипетированием и образовавшуюся взвесь перенести обратно в пробирку с защелкивающейся крышкой; |
| Слюна, спинномозговая жидкость (ликвор), синовиальная жидкость, слезная жидкость | - отобрать 1-1,5 мл исходного материала в сухую стерильную пробирку типа Эппендорфф вместимостью 1,5 мл; - материал для исследования должен быть свежим (не охлаждать и не замораживать!); - получение осадка для исследования: - отцентрифугировать пробирки с исходным материалом в течение 10-15 минут при 12000 об/мин; - тщательно удалить пипеткой надосадочную жидкость, оставив на дне пробирки около 50 мкл жидкости с осадком; - к осадку в пробирке добавить весь реактив (200 мкл) из одной пробирки из комплекта “ДНК-ЭКСПРЕСС”, тщательно перемешать пипетированием и полученную суспензию перенести обратно в пробирку с защелкивающейся крышкой; |
| Мазок из ротоглотки | - взятие мазка проводить натощак или не ранее, чем через 2-4 часа после еды; - корень языка придавить шпателем, материал взять стерильным зондом вращательными движениями с поверхности миндалин, небных дужек или задней стенки глотки; - извлечь зонд, не касаясь языка, слизистой щек и зубов и опустить в пробирку с реагентом “ДНК-ЭКСПРЕСС”; |
| Соскоб с коньюктивы | - при наличии обильного гнойного отделяемого убрать его стерильным ватным тампоном, смоченным физиологическим раствором; - взять соскоб с внутренней поверхности нижнего века движением к внутреннему углу глазной щели, при взятии соскоба необходимо придерживать веко руками, чтобы при моргании ресницы не касались зонда; - извлечь зонд и опустить в пробирку с реагентом “ДНК-ЭКСПРЕСС”; |
| Смыв из ротоглотки и из полости носа, промывные воды бронхов, бронхо-альвеолярный лаваж | Бронхо-альвеолярный лаваж и промывные воды бронхов: - собирают в одноразовые плотно завинчивающиеся пробирки в количестве 50 мл; Смыв из ротоглотки: - предварительно прополоскать полость рта водой; - прополоскать ротоглотку 8-10 мл стерильным физ. раствором в течение 10-15 сек, собрать смыв через воронку в стерильную пробирку; Смыв из полости носа: - ввести с помощью шприца по 3-5 мл стерильного физ. раствора в оба носовых хода, собрать смыв через воронку в стерильную пробирку; - получить осадок из исходного материала так же как описано для осадка мочи, перенести в пробирку с реагентом “ДНК-ЭКСПРЕСС”. |
| Биоптат слизистой желудка | - биопсийный материал берется во время эндоскопического исследования; - перед началом терапии биопсийный образец берется из антрального отдела желудка; - при контроле лечения взятие биопсийного образца проводится из тела желудка не ранее чем через 4 недели после проведения терапии; - биопсийный образец поместить в стерильную сухую пробирку типа Эппендорф; |
| Мокрота, плевральная жидкость | - в пластиковую центрифужную пробирку объемом 50 мл с плотно завинчивающейся крышкой собрать 10 мл мокроты или плевральной жидкости; - приготовить смесь NALC следующего состава ( на 5 проб мокроты): - 0.25 г ацетил-цистеина, 25 мл 4% NaOH, 25 мл 0.1М триNa цитрата (готовые исходные растворы на 100 образцов входят в состав “Комплекта для разжижения мокроты”) Смесь готовят в день использования (раствор не хранится). - к образцу в пробирке добавить равный объем NALC, перемешать на вортексе в течение 5-20 секунд, инкубировать 15 минут при комнатной температуре, а затем развести 0.067М фосфатным буфером (рН 6.8) до 50 мл; - центрифугировать 15 минут при 3000 об/мин, удалить надосадочный раствор. |
| Кал | Кал в количестве 20 – 30 мг ( объем спичечной головки) собранный из трех различных точек средней фракции, поместить в пробирку с транспортной средой ( для гельминтов). Хранить отобранный материал в холодильнике при + 4С-+6С не более 3-х суток. Материал не должен подвергаться УФЛ – облучению, замораживанию |
| МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКАЯ (ПЦР) ДИАГНОСТИКА ДЕРМАТОФИТЫ | Материалом для исследования на дерматофиты служат: - фрагменты ногтевой пластинки (на границе пораженного ногтя и здорового ногтя), материал собрать в сухую пробирку Эппендорф - волосы ( 10 -20 -50 волосинок щипчиками выдернуть, отрезать прикорневую зону вместе с луковицами волос, а также чешуйки гриба в прикорневой зоне), материал собрать в сухую пробирку Эппендоррф - соскоб с кожи ( участок на границе здоровой и пораженной кожи смазать вазелиновым маслом и скарификатором сделать соскоб ), материал поместить в сухую пробирку Эппендорф. |